摘要  脐血造血干细胞移植后血小板恢复延迟是困扰临床的一大难题，目前认为这主要与脐血中巨核系祖细胞数量不足及脐血巨核细胞分化成熟延迟有关，而将部分脐血进行巨核系前体细胞体外扩增后输注受者体内是有望解决这一难题的重要途径，但适用于临床应用的扩增条件至今仍未确立。本课题采用脐血单个核细胞（MNC）在无血清培养体系中使用TPO、IL-3、SCF、IL-6等细胞因子进行不同的组合，在培养的0、6、10、14天进行有核细胞（NC）、CD41⁺细胞及CFU-MK数的检测，以寻找最佳的细胞因子组合及最佳的收获时机。结果：无血清条件下，使用血小板生成素（TPO）联用IL-3、干细胞因子（SCF）、IL-6等细胞因子可实现脐血MNC巨核系前体细胞有效的体外扩增，各因子组中以TPO+IL-3+SCF+IL-6组扩增效果为最佳，其CFU-MK数于第10天最多，扩增达6.8倍，CD41⁺细胞扩增8.8倍。结论：在脐血MNC无血清培养条件下，TPO+IL-3+SCF+IL-6组为巨核系体外扩增较佳的因子组合。由于TPO+IL-3+SCF+IL-6组的CFU-MK数于第10天最多，CD41⁺细胞数亦为同期最高，故培养后收获时间宜控制在其体外培养的第10天。

关键词 脐血；单个核细胞；无血清培养；血小板生成素；巨核细胞

目前，脐血造血干细胞移植已在全世界广泛开展，成为治疗良、恶性血液系统疾病的重要手段。但移植后血小板恢复延迟一直是困扰临床的一大难题。而取出部分的脐血进行巨核系前体细胞的体外扩增及适当的诱导成熟，然后与未扩增部分一并输注回受者体内，从而加速体内血小板的恢复是有望解决这一难题的重要途径。近年来大量的研究证实，脐血巨核系定向扩增是可行的，且效果明显优于骨髓及外周血造血干细胞，通过动物实验，已证实能有效地加速NOD/SCID小鼠的血小板恢复，因而具有近期内实现的可能性。

目前普遍认为脐血巨核系体外扩增效能主要与以下因素有关：1、细胞因子的选择及组合；2、培养的条件，包括：起始细胞的选择、培养基中的血清含量等。

关于脐血巨核系体外扩增起始细胞应使用MNC还是CD34⁺细胞还存在着争议^]，但综合而言，使用MNC作为脐血培养起始细胞显得更有优势、实用性更强。此外，经研究证实，无血清培养体系的巨核系体外扩增效能明显优于含血清培养体系。

目前，在国外使用无血清培养体系进行CD34⁺细胞脐血巨核系定向诱导的研究较多，在国内亦有学者采用含血清体系进行了脐血CD34⁺细胞巨核系定向诱导的研究，但在国内使用脐血MNC在无血清培养基进行巨核系前体细胞体外扩增的研究未见报道。

综上所述，本实验拟采用脐血MNC在无血清培养条件下使用不同的细胞因子组合进行巨核系前体细胞的体外扩增，从而寻找最佳的因子组合及收获时间，为脐血巨核系定向扩增的临床应用摸索条件。

材料与方法

研究对象

以从足月正常分娩的健康产妇脐静脉采集的脐血MNC为研究对象，脐血由广州医学院附属广州市第一人民医院妇产科提供。

主要试剂

HES（含6%羟乙基淀粉的0.9%氯化钠注射液）购自美国B.Braun公司。淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺、Ficoll-Hypaque）购自中国医学科学院血液研究所。TPO、IL-3、SCF、IL-6均购自英国Pepro Tech公司，溶解后在-20℃保存。无血清培养液使用StemSpan^TMSFEM，购自加拿大Stem Cell Technologies公司。巨核系集落培养及鉴定体系使用MegaCult^TM-C试剂盒，购自加拿大Stem Cell Technologies公司。

MNC的分离

采集足月妊娠的健康产妇脐血，以肝素抗凝（20-30U/ml），脐血采集量在40-60ml之间，共采集6例，采集后2小时内进行分离处理。先将脐血与HES按5：1混和，静置30分钟沉淀去除红细胞。取上层液体按2：1加到淋巴细胞分离液（相对密度：1.077）的液面上层，以1700rpm（460g）离心25分钟，采集界面层MNC，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次。按1×10⁷/ml细胞浓度加入无血清培养液StemSpan，在5%CO₂、37℃及饱和湿度条件下在6孔培养板中孵育2小时，以去除粘附细胞及残余血小板。孵育后，取出去粘附后MNC，用PBS 800rpm（100g）洗涤1次后备用。

细胞的培养接种

将去粘附后MNC按1×10⁶/ml接种于无血清培养液StemSpan中，在StemSpan中加入青霉素（100U/ml）、链霉素（100ug/ml）及细胞因子。按细胞因子组合的不同分组如下：阴性对照组；A、TPO+IL-3组；B、TPO+ IL-3+ SCF组；C、TPO+IL-3+SCF+IL-6组。细胞因子终浓度为：TPO 50ng/ml，IL-3 20 ng/ml，SCF 50 ng/ml，IL-6 20 ng/ml。培养体系接种于50ml培养瓶中，每瓶液体总量为6ml，在5%CO₂、37℃及饱和湿度条件下培养14天，第6、10天进行1/3量换液，加入新鲜培养液及相同浓度的细胞因子。

NC、CD41⁺细胞、CFU-MK的检测

在培养的0、6、10、14天取出细胞行NC数、流式CD41⁺细胞比例及CFU-MK的检测。NC为人工计数，CD41⁺细胞比例由流式细胞仪检测，而CFU-MK用MegaCult^TM-C试剂盒（包含无血清集落培养液、胶原及与CD41结合的原位APAAP染色系统）进行检测。

统计学分析

实验数据以X+SD表示，所有数据均采用SPSS软件分析，统计方法为ANOVA，P<0.05为显著性差异，P<0.01为高度显著性差异。

结   果

脐血MNC细胞分离

每次采集的脐血在40-60ml之间，经羟乙基淀粉沉淀后淋巴细胞分离液离心分离MNC，去粘附细胞后得0.98+0.33×10⁸的MNC（0.7~1.3×10⁸），CD34⁺细胞比例为1.20+0.33%（0.8~1.7%）。

不同细胞因子组合对细胞总数的扩增作用

Chart 1.NCs expansion effect of different cytokine combinations（n=6）

如Chart1、Figure1所示，对照组在未加入细胞因子情况下，NC数呈进行性下降，而各因子组在6、10、14天的NC数呈进行性上升。各因子组的NC数在不同时间点（除0天外）均明显高于对照组，其差异有高度显著性意义（P<0.01）。而B组及C组的NC数在不同时间点均明显高于A组，其差异有高度显著性意义（P<0.01）。但B组与C组的细胞数在不同时间点并未见显著性差异（P>0.05）。其中后两组细胞因子在第10、14天细胞数分别扩增了约3.4及4.7倍。

不同细胞因子组合对CD41⁺细胞的扩增作用

Chart 2.CD41⁺ cells expansion effect of different cytokine combinations（n=6）

如Chart2、Figure2所示，各细胞因子组在6、10、14天的CD41⁺细胞总数呈进行性上升。各因子组的CD41⁺细胞数在不同时间点（除0天外）均较对照组明显增加，其差异有高度显著性意义（P<0.01）。在各因子组中，经6、10、14天3个不同时间点的比较，均发现C组CD41⁺细胞产量为最高，B组次之，而A组较差，其差异均有高度显著性（P<0.01）。在C组中，CD41⁺细胞数于第14天达最高峰，第10、14天CD41⁺细胞数各扩增了约8.8及17.5倍。

不同细胞因子组合对CFU-MK的扩增作用

Chart 3.CFU-MKs expansion effect of different cytokine combinations（n=6）

如Chart3、Figure3所示，各细胞因子组在培养的0、6、10天每ml培养细胞的CFU-MK数呈进行性上升，但到第14天CFU-MK数有所减少。各因子组的CFU-MK数在不同时间点（除0天外）均较对照组明显增加，其差异有高度显著性意义（P<0.01）。而B组及C组的CFU-MK数在不同时间点（除0天外）较A组明显增加，其差异有高度显著性意义（P<0.01）。但B与C组的CFU-MK数在6、10天并未见显著性差异（P>0.05），但在第14天C组的CFU-MK数多于B组，差异有高度显著性意义（P<0.01）。其中最后一组在第6、10、14天的CFU-MK数分别扩增了约5.6、6.8、5.6倍，CFU-MK总数最高峰在B、C组培养至第10天时出现，且大、中的CFU-MK亦多在培养第6、10天出现（形态如Figure1所示）。

讨 论

关于起始细胞的选择

关于选择何种细胞作为脐血体外扩增的起始细胞，是否需要进行CD34⁺细胞分选，目前还存在着争议。但以下几点是明确的： 1、CD34⁺ 细胞阳性分选不可避免地导致Lin^-CD34^-这些更早期造血细胞的丢失。2、CD34⁺细胞阳性分选不可避免地导致40%左右CD34⁺细胞的丢失。3、在2周培养期间，MNC培养后的CD34⁺比例可较前升高，而CD34⁺细胞培养后的CD34⁺细胞比例呈进行性下降。4、以每CD34⁺细胞产巨核细胞数作为比较标准，MNC优于CD34⁺细胞。基于以上理由，本实验选用脐血MNC作为培养的起始细胞。

关于培养基的选择

目前使用的培养基包括含血清及无血清两种，研究证实，血清中存在转化生长因子-ß、血小板4因子及ß-血小板球蛋白等巨核系增殖的抑制物，且培养体系中过多血清的存在，不仅抑制了巨核系细胞的增殖，而且限制了其临床的应用，同时还影响了扩增效果的可重复性及可比性。目前经血清替代物的反复尝试及改良，巨核系细胞的无血清定向扩增，其效能已明显优于含血清的对照组，故现巨核系体外扩增大都使用无血清培养基。目前常用的无血清培养基包括StemSpan、Cellgro等，经比较发现StemSpan的巨核系扩增效能优于Cellgro。因而，本实验选择StemSpan为实验用的无血清培养基。

细胞因子组合的选择

最近在脐血巨核系定向扩增研究中发现，脐血移植后血小板恢复延迟不仅与巨核系祖细胞数量不足，而且还可能与脐血巨核细胞较幼稚，分化成熟延迟有关，因而在扩增策略上，在实现脐血巨核系祖细胞扩增的同时，还需适当地诱导产生部分较成熟的巨核系前体细胞，从而更好地支持近期内的血小板恢复。因而在选择因子组合方面必须要兼顾巨核系祖细胞扩增及适当诱导成熟两个方面。TPO或巨核细胞生长发育因子（MGDF）在体外不仅能促进巨核系祖细胞的体外扩增，而且还能促进巨核细胞的分化成熟，是巨核系体外扩增及诱导成熟的关键性因子。在体外常用的协同作用因子中，主要协同促进巨核系祖细胞扩增的早期作用因子包括：IL-3、SCF、FL等，而主要协同促进HSC向巨核系分化及诱导成熟的晚期作用因子包括：IL-6、IL-11等。

由于在预试验中发现，过多的早期作用因子可导致脐血MNC向非巨核系尤其是粒系分化，反而降低了巨核系的扩增效能，因而在早期协同作用因子方面，我们仅选用了IL-3、SCF，而没有用FL。在晚期协同作用因子方面，IL-6与IL-11为同族的细胞因子，对巨核系作用相仿，我们选用了IL-6。为适应临床使用细胞因子组合简便、有效的原则，因而在实验设计上，我们以TPO+IL-3作为第1个因子组，继而逐一加上SCF、IL-6，目的在于尝试在无血清MNC条件下寻找尽可能简单的细胞因子组合，并研究各因子对脐血MNC巨核系定向扩增的作用。

实验发现，TPO+IL-3+SCF及TPO+IL-3+SCF+IL-6组的NC扩增倍数为最高，但两者在不同时间点NC数未见显著性差异，这提示，IL-3、SCF等早期作用因子能协同促进MNC总数的扩增，而IL-6对NC总数扩增并无明显作用。

在CD41⁺细胞扩增研究中，TPO+IL-3+SCF+IL-6所得的CD41⁺细胞数在不同时间点（除0天外）均为最多，扩增倍数最高，提示TPO在早、晚期作用因子的协同作用下，能实现巨核系更加有效的扩增，获得更多较成熟的巨核细胞。

在CFU-MK数扩增研究中，以TPO+IL-3+SCF及TPO+IL-3+SCF+IL-6的CFU-MK的扩增倍数为最高，两者在第6、10天的CFU-MK总数虽无显著性差异，但后者的CFU-MK总数均略高于前者。在第14天，后一组的CFU-MK数高于前一组，且差异具有显著性意义。这提示IL-6可能如Lazzari等报道，有一定协同诱导脐血造血干细胞向巨核系祖细胞分化的作用，而6、10天差异未具显著性意义可能与IL-6诱导分化能力较弱和/或统计例数尚不足有关。

在各因子组间的比较中，我们发现，TPO与早、晚期作用因子的合理搭配是增加其巨核系定向扩增效能的关键，最佳的细胞因子组合为TPO+IL-3+SCF+IL-6，它不仅能实现CFU-MK较大程度的扩增，而且CD41⁺细胞产量亦最高，这个研究结果与裴雪涛等的报道相同。

脐血巨核系定向扩增后收获及临床输注的最佳时机

我们发现TPO+IL-3+SCF+IL-6组CFU-MK总数于第10天达到最高峰，共扩增了约6.8倍。相对而言，Pick采用新鲜及解冻后脐血的MNC使用TPO+SCF在无血清条件下进行巨核系的体外扩增，其产出CFU-MK总数的最高峰时间与我们相仿（第7~10天），但总扩增倍数较我们稍低（4.4~5.0倍），估计可能与其没有联合使用IL-3、IL-6有关。

由于脐血移植后血小板恢复时间主要与巨核系祖细胞数量呈负相关，同时亦受巨核细胞成熟延迟的影响，而TPO+IL-3+SCF+IL-6组在培养的第10天，不仅CFU-MK数达最高数值，而且CD41⁺细胞也较同时间的其它因子组高，提示在这个时间点，不仅巨核系祖细胞数最多，而且较成熟的巨核细胞亦较多，有可能可以较好地支持近期及较远期的巨核系重建，因而可作为收获的较佳时机。

参考文献（略）

Figure 1.CFU-MKs detected by MegaCult^TM-C kit