【摘要】  目的  探讨交感神经递质对人前列腺上皮细胞增殖和凋亡的作用。方法  在不同浓度的苯肾上腺素下培养人前列腺上皮细胞系BPH₁，观察苯肾上腺素对前列腺上皮细胞增殖和凋亡的影响及其能否被盐酸特拉唑嗪阻断。结果  苯肾上腺素能够刺激体外培养的人前列腺上皮细胞数量增加，并且随着苯肾上腺素浓度的增加，细胞数量增加明显，（r₁=0.821,  p< 0.05）；苯肾上腺素能够增加体外培养的人前列腺上皮细胞上清液A值，随着苯肾上腺素浓度的增加，A值增加更明显（r₂=0.854, p< 0.05）；苯肾上腺素能够增加体外培养的人前列腺上皮细胞S期细胞所占的比例，并且随着苯肾上腺素浓度的增加，S期细胞所占的比例增加(r₃=0.850, p< 0.05 )，这种作用能被盐酸特拉唑嗪阻断。苯肾上腺素不能诱导或抑制体外培养的前列腺上皮细胞发生凋亡。结论  苯肾上腺素能通过α1受体途径刺激前列腺上皮细胞增殖。

【关键词】  苯肾上腺素；  前列腺上皮细胞；增殖；凋亡

材料和方法

1、材料：人前列腺上皮细胞系BPH1由天津南开大学分子生物学研究所提供，分别在有和无盐酸特拉唑嗪的不同浓度苯肾上腺素下培养（见表1）。

2、细胞计数：0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化贴壁的细胞,制成单细胞悬液，密度为20000/ml，接种于50ml的培养瓶，每瓶加入4ml细胞悬液，每组3瓶，孵育24h后换为含 0.1% 胎牛血清（无血清）的DMEM培养基，令全体细胞同步化于G₀期，继续培养48小时，换为含1%胎牛血清的DMEM培养基，同时加入表1中不同终浓度的苯肾上腺素或/和特拉唑嗪，培养72小时后终止反应，用血球计数板在光学显微镜下进行细胞计数。

3、四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖：0.25%胰酶和0.02%EDTA消化贴壁的细胞,制成单细胞悬液，置于96孔板中，每组3孔，每孔200µl，细胞密度为20000/ml，孵育24小时，每孔换为含 0.1% 胎牛血清的DMEM培养基，令全体细胞同步化于G₀期，继续培养48小时，各组孔板换为含有表1中不同终浓度的苯肾上腺素或/和特拉唑嗪的DMEM培养基（1%胎牛血清），孵育72小时，每孔换为用DMEM培养液（1%胎牛血清）配制成的MTT溶液，MTT终浓度为1mg/ml, 37℃温育4小时。弃去MTT溶液，每孔加入二甲基亚枫 （DMSO）溶液，轻微震荡10min，待甲肷产物充分溶解。用酶标仪在波长560nm下测定吸光度（OD值）。

4、流式细胞仪检测细胞周期中S期细胞百分比：按1×10⁵个细胞/ml分别接种于50ml培养瓶中，孵育24小时后，换用含0.1%胎牛血清的DMEM培养基，使细胞同步化，培养48小时，换为含有表1中不同终浓度的苯肾上腺素或/和特拉唑嗪的DMEM培养基（1%胎牛血清），培养72小时。收集细胞，离心5min(1800r/min)，磷酸盐缓冲液PBS 洗2次，重悬细胞，使其密度为5×10⁶/ml ，分别取100µl的单细胞悬液，加入200µl的破膜剂（DNA-Prep LPR）混匀，使细胞裂解破膜， 8sec后加入2ml 细胞周期检测试剂（DNA-Prep Stain）混匀（包含50µg/ml碘化丙啶和4ku/ml RNAse），其中RNAse能使DNA酶失活，碘化丙啶（PI）用于染色细胞。室温避光放置半小时，即上流式细胞仪检测细胞周期（激发波长488nm）。

5、流式细胞仪检测细胞凋亡：按1×10⁵细胞/ml分别接种于50ml培养瓶中，培养2d后换为用含1%胎牛血清的DMEM培养基配成的表1中不同终浓度的苯肾上腺素或/和特拉唑嗪，培养3d后收集细胞，密度为10⁵~10⁶/ml，分别取单细胞悬液100µl，加入5µl异硫氰酸荧光素标记的Annexin Ⅴ和2.5µlPI, 轻轻混匀 。4℃冰箱孵育10min。各管加150µl 4℃孵育缓冲液，每组3管，用流式细胞仪（激发光波长488nm，散射光波长630nm）检测细胞凋亡率。

6、统计学方法：数据以x+s表示，组间比较采用单因素方差分析，相关关系采用直线相关来检验，以SPSS10.0软件做统计分析。

结   果

1、苯肾上腺素对细胞增殖的影响：苯肾上腺素能够刺激体外培养的人前列腺上皮细胞数量增加，并且随着苯肾上腺素浓度的增加，细胞数量增加明显，（r₁=0.821  p< 0.05）；苯肾上腺素能够增加体外培养的人前列腺上皮细胞上清液OD值，随着苯肾上腺素浓度的增加，OD值增加更明显（r₂=0.854  p< 0.05）；苯肾上腺素能够增加体外培养的人前列腺上皮细胞S期细胞所占的比例，并且随着苯肾上腺素浓度的增加，S期细胞所占的比例增加(r₃=0.850 p< 0.05 ),这种增殖作用能被a1受体阻滞剂盐酸特拉唑嗪阻断（见表2）。

2、苯肾上腺素对体外培养的人前列腺上皮细胞凋亡率的影响：与第2~10组与第1组（对照组）比较差异均无显著性，p > 0.05。

讨   论

BPH的病因复杂，涉及到多个因素和环节，它的发病是由于各种因素导致前列腺细胞的增殖增多和/或凋亡减少引起。有研究表明，交感神经递质可能通过肾上腺素能受体(α₁-AR)在BPH的发病中起重要作用。α₁-AR不仅存在于前列腺基质中，而且也存在于前列腺上皮。我们用苯肾上腺素，一种人工合成的交感神经递质，α1受体激动剂，来研究交感神经递质对前列腺上皮细胞的影响。结果提示：苯肾上腺素能够刺激体外培养的人前列腺上皮细胞增殖，并且这种增殖作用随着苯肾上腺素浓度的增加而增强。盐酸特拉唑嗪，一种α1受体阻滞剂，对细胞增殖没有影响，与Kyprianou等，Chon等,Simone等研究结果一致。用盐酸特拉唑嗪阻滞α1受体后，各浓度的苯肾上腺素对前列腺上皮细胞的增殖作用几乎消失。

我们认为，苯肾上腺素激活α1-AR后， 可能通过以下途径促使前列腺上皮细胞增殖：

1、交感神经递质对细胞生长的直接影响。一些神经肽除了神经递质功能外，还有促有丝分裂的作用，通过激活细胞内受体来刺激细胞增殖。

2、对内分泌的影响。神经递质可能通过改变血内不同激素（如雄性激素或雌激素）的水平或靶组织对这些激素的敏感性来影响前列腺细胞的生长

3、对旁分泌和自分泌的影响。神经递质调控生长因子的旁分泌和自分泌及原癌基因的表达，通过上皮-基质的相互作用而促进细胞生长。结果还表明苯肾上腺素不影响前列腺上皮细胞的凋亡。所以交感神经递质有可能通过α₁受体途径增加细胞增殖而在BPH的发病中起一定的作用。为我们临床通过支配前列腺的神经阻滞治疗BPH提供理论基础。                          

参考文献（略）