摘要:目的：探讨地塞米松对系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）患者外周血单核细胞核蛋白中转录因子STAT1 (Signal transducer and activator on transcription 1)的DNA结合活性和表达量的调控。方法： 5例活动期SLE患者进入本研究。采用凝胶滞留法（Electrophoretic mobility shift assay， EMSA）检测了地塞米松对系统性红斑狼疮患者外周血单核细胞核蛋白中转录因子STAT1的DNA结合活性的调控，并对其进行了定量分析。结果：地塞米松可显著抑制SLE患者外周血单核细胞中转录因子STAT1的DNA结合活性和表达量。在地塞米松浓度为10^-6M时，转录因子STAT1的DNA结合活性和表达量可被抑制60%以上。经统计学分析，发现地塞米松处理组和地塞米松未处理组之间有显著性差异（P<0.05）。动态研究发现地塞米松对转录因子STAT1的DNA结合活性的抑制最早可发生于加入地塞米松8小时后；加入地塞米松12小时后此抑制具有显著性。地塞米松对转录因子STAT1的DNA结合活性和表达量的抑制可持续到48小时以后。结论：地塞米松对转录因子STAT1的DNA结合活性和表达量的抑制可能是其发挥免疫抑制作用的又一机制。

关键词：单核细胞  系统性红斑狼疮  转录因子STAT1

系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及全身多个系统的自身免疫病，血清中出现多种自身抗体，并有明显的免疫紊乱。近年来研究证实SLE患者有多种细胞因子及其受体，粘附因子及其配体的异常，如：SLE患者血清中IFN水平明显增高，并与疾病的活动性和严重性相关。SLE患者也存在转录因子，如AP-1，NF-kB，STAT1等的异常。Kuroiwa等人近来的研究结果表明SLE患者外周血单核细胞中转录因子STAT1（Signal transducer and activator of transcription 1）基础表达明显增高，提示转录因子STAT 1与SLE的发病相关。Hu等人已经报道糖皮质激素可降低IFN-g引起的STAT1的DNA结合活性和表达。尽管糖皮质激素是目前治疗系统性红斑狼疮的主要药物，但是糖皮质激素是否能够调控系统性红斑狼疮患者外周血单核细胞核蛋白中转录因子STAT1的DNA结合活性和表达量仍未见报道。凝胶滞留法（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）常用来检测各种转录因子的DNA结合活性，并可对与特异共有DNA序列结合的转录因子作出定量分析。本研究采用凝胶滞留法检测了地塞米松是否能够调控SLE患者外周血单核细胞核蛋白中转录因子STAT1的DNA结合活性和表达。现报道如下：

对象和方法

研究对象：5例SLE患者均符合1982年美国风湿病学会（ARA）SLE分类标准。SLE活动性指标采用SLE DAI （SLE disease activity index）进行判定。进入此研究的活动期患者均为初发病未使用激素和免疫抑制剂治疗的患者，且处于显著活动期。

单核细胞的分离和培养：外周血单核细胞的分离参照丹麦Nycomed公司提供的方法进行。取10ml单核细胞分离液（Nycomed，丹麦）置于50ml离心管中（Leucosep tubes，Greiner. 德国）在100g离心力条件下离心2 min。将以EDTA抗凝血的全血20ml加在frit滤网之上，然后室温，800g，离心15 min。收集处于界面的细胞，以PBS洗两次，记数，重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640中，37°C，培养2小时。去除未贴壁细胞后，收集贴壁细胞。经流式细胞仪以CD14检测单核细胞纯度介于80%-90%；经胎盘兰检测，活性大于98%。将单核细胞在含10%胎牛血清、3%自体血清和地塞米松10^-6 M的RPMI 1640中培养一定的时间，然后检测单核细胞核蛋白中转录因子STAT1的DNA结合活性和表达。

核蛋白的提取：核蛋白的提取采用Cellytic^TM Nuclear^TM提取试剂盒（Sigma，美国）。收集单核细胞，向细胞团块加入适量裂解液，使细胞膜肿胀破裂，然后加入Igepal CA63到终浓度为0.2%。剧烈振荡混匀后，收集细胞核。随后将细胞核重悬于核蛋白的提取液中，剧烈振荡混匀，并且进行三次以上快速冻融。离心收集核蛋白，经液氮快速冷冻后，置-80°C保存备用。在核蛋白的提取时，必须确保核蛋白的生物活性。核蛋白浓度检测采用Bradford试剂盒（Bio-Rad Hercules, CA，美国）。

凝胶滞留法（Electrophoretic mobility shift assay）：GAS/ISRE共同序列寡核苷酸探针和EMSA GAS/ISRE变异序列寡核苷酸探针（表1）购自Santa Cruz（美国），DIG-11-ddUTP标记采用罗氏公司地高辛标记试剂盒。取核蛋白10mg与1-2ng DIG-11-ddUTP标记的寡核苷酸探针进行反应。反应结束后，采用未变性聚丙烯酰凝胶分离DNA-核蛋白结合体。电泳完毕将DNA－核蛋白复合体转移到尼龙膜上。采用罗氏公司DIG抗体和化学发光法检测特异性条带。DNA－核蛋白复合体的特异性采用竞争试验和超滞留试验（super shift assay）进行确定。STAT1阳性对照和多克隆抗体购自美国Genaka biotechnology公司。特异条带经密度扫描后，使用NIH Image软件进行定量分析。

统计学处理：各组之间的比较用配对t检验。P<0.05, 差异有显著性。

结  果

1．地塞米松可显著抑制转录因子STAT1的DNA结合活性和核蛋白中的含量。

SLE患者单核细胞分离纯化后，在含10%胎牛血清和3%自体血清的RPMI 1640中进行培养。地塞米松浓度为10^-6M，因为预实验结果显示此浓度不影响细胞的活性，排除了地塞米松的作用是由其细胞毒性所引起。加入了3%的自体血清是为了尽可能使体外培养环境更接近体内环境。培养24小时后，提取核蛋白，以EMSA检测了多个SLE患者单核细胞来源核蛋白中转录因子STAT1的DNA结合活性和含量。在地塞米松浓度为10^-6M时，地塞米松可显著抑制SLE患者外周血单核细胞中转录因子STAT1的DNA结合活性和表达量，转录因子STAT1的DNA结合活性和表达量可被抑制60%以上。5例患者结果一致，均为地塞米松显著地抑制转录因子STAT1的DNA结合活性和核蛋白中STAT1含量（图1）。表2所示为特异条带经密度扫描的结果。经使用NIH Image软件进行定量分析和统计学处理，显示地塞米松处理组和未经地塞米松处理组之间有显著性差异（t=2.87, P<0.05）。

2．地塞米松对转录因子STAT1抑制的时间效应关系

在地塞米松浓度为10^-6M浓度条件下，本研究还检测了地塞米松对转录因子STAT1抑制的时间效应关系。SLE患者单核细胞分离纯化后，给予地塞米松处理，在不同的时间点收集单核细胞，分离核蛋白。经EMSA检测和对特异性寡聚核苷酸与STAT1的结合条带进行密度扫描和NIH Image软件处理后，发现地塞米松对STAT1的DNA结合活性和量的抑制最早可发生于加入地塞米松8小时后，12小时后此抑制具有显著性，并且此抑制可持续到48小时（图2）。图3所示为阳性对照实验结果（泳道1），抑制实验的实验结果（泳道2－3）和超滞留实验的实验结果（泳道4）。可见SLE患者的转录因子STAT1的DNA结合特异带与阳性对照大小一致；泳道2为加入变异序列寡核苷酸探针，泳道3为加入共同序列寡核苷酸探针，可见变异序列寡核苷酸探针不能抑制转录因子STAT1的DNA结合特异带；共同序列寡核苷酸探针能抑制转录因子STAT1的DNA结合特异带。泳道4所示为加入STAT1多克隆抗体，转录因子STAT1的DNA结合特异带明显滞后。此结果进一步证实了滞留实验结果的特异性。

讨  论

STAT蛋白存在于细胞浆中，是由7个转录因子组成的大家族，它们参与某些细胞因子、趋化因子、激素以及生长因子等的信号传导 。STAT蛋白构成性地表达于多种组织和系统中，STAT可参与免疫性细胞的发生、分化和成熟。近年来，研究还证实STAT与T细胞的体内免疫平衡有关。STAT家族蛋白经连接在多种因子受体胞内的Janus激酶磷酸化后，形成同二聚体或异二聚体进入细胞核，与特异的DNA序列结合，调控基因的表达，从而使各种细胞因子、生长因子和激素的生物作用得以实现。已有报道糖皮质激素可抑制STAT家族中转录因子STAT5、STAT6参与的信号传导。本研究发现地塞米松可显著抑制SLE患者外周血单核细胞中转录因子STAT1的活性和含量。此抑制作用可发生于加入地塞米松8小时后，且持续到48小时。这一发现与Hu等人报道的糖皮质激素可显著抑制IFN-g引起的STAT1的DNA结合活性的结果是一致的。本文结果提示，转录因子STAT 1也是一种受肾上腺糖皮质激素调控的核蛋白。

肾上腺糖皮质激素广泛地应用于自身免疫性疾病的治疗。肾上腺糖皮质激素通过结合到位于靶细胞胞浆中的糖皮质激素受体而发挥其生物作用。肾上腺糖皮质激素可作用于炎症过程的多个方面而抑制炎症。它能够升高抗炎症基因的转录和降低炎症基因的转录。近年来的临床实践表明：肾上腺糖皮质激素是治疗SLE的主要药物。Kuroiwa等人的研究发现SLE患者外周血单核细胞中转录因子STAT1表达明显增高，此结果表明STAT1参与了SLE 的发病。因此，本研究检测了地塞米松，一种糖皮质激素制剂，是否能够调控SLE患者外周血单核细胞中转录因子STAT1的DNA结合活性和表达量，发现地塞米松可显著抑制SLE患者外周血单核细胞中转录因子STAT1的活性和含量，提示糖皮质激素可通过影响STAT1而发挥其免疫抑制作用。

参考文献（略）

表 1. GAS/ISRE 寡聚核苷酸探针的共有序列和变异序列

GAS/IRSE consensus oligonucleotide

5’ --AAG TAC TTT CAG TTT CAT ATT ACT CTA -- 3’

3’ --TTC ATC AAA GTC AAA GTA TAA TGA GAT -- 5’

GAS/IRSE mutant oligonucleotide

5’ --AAG TAC TTT CAG TGG TCT ATT ACT CTA -- 3’

3’ --TTC ATC AAA GTC ACC CGA TAA TGA GAT -- 5’

表2. 地塞米松对STAT1 DNA结合活性的抑制效应结果